This post is also available in: English (English)

Điện di là một quá trình điện động học tách các hạt mang điện trong chất lỏng bằng cách sử dụng điện trường. Đây là phương pháp để phân tích các phân tử protein, DNA, RNA hoặc polysaccharide thông qua một số cách thức điện di khác nhau tùy thuộc vào loại và kích thước của phân tử.

NGUYÊN LÍ ĐIỆN DI

Điện di hoạt động dựa trên nguyên lý các phân tử sinh học tồn tại dưới dạng các hạt mang điện, sở hữu các nhóm chức có thể ion hóa. Các phân tử sinh học trong dung dịch ở độ pH nhất định sẽ tồn tại dưới dạng các ion tích điện dương hoặc âm.

Khi chịu tác động của điện trường, các phân tử sinh học bị ion hóa sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau, tùy thuộc vào khối lượng và điện tích của mỗi hạt trong dung dịch – hạt mang điện tích âm (anion), sẽ di chuyển về phía điện cực dương, và các hạt mang điện tích dương (cation), sẽ bị kéo về phía điện cực âm.

CÁC HÌNH THỨC ĐIỆN DI

Dựa trên loại dung dịch đệm và ảnh hưởng của nó đối với tính linh động của các hạt mang điện, điện di có thể được chia thành bốn dạng như sau:

1. Điện di ranh giới di chuyển (Moving boundary electrophoresis)

Điện di ranh giới di chuyển được coi là hình thức ban đầu của điện di. Mẫu để tách được thực hiện trong dung dịch tự do, trong ống hoặc ống mao dẫn, dưới giá trị pH không đổi trong suốt quá trình tách.

Một ưu điểm chính của điện di trong dung dịch tự do là khả năng đo sự chuyển động của các hạt phân tách mà không có các yếu tố can thiệp khác không liên quan đến các hạt phân tách. Tuy nhiên, hình thức điện di này dễ bị ảnh hưởng bởi dòng đối lưu và độ phân tách thấp do sự trộn lẫn của các mẫu trong dung dịch đệm có thể dẫn đến sự chồng chéo của các thành phần hoặc các hạt có đặc điểm tương tự.

2. Điện di vùng (Zone electrophoresis – ZE)

Điện di vùng tương tự như điện di ranh giới di chuyển ở chỗ sự phân tách điện di diễn ra trong một hệ thống đệm đồng nhất. Hình thức này thường sử dụng môi trường hỗ trợ hoặc chất nền để làm dịu dòng đối lưu và ngăn chặn sự khuếch tán mẫu không kiểm soát được. Chất nền, trong hầu hết các trường hợp, cũng cung cấp một hiệu ứng sàng lọc bổ sung có ảnh hưởng đến sự phân tách điện di.

Các mẫu để tách ZE được bao quanh bằng dung dịch đệm điện di và được phân tách trong chất nền trong một thời gian tách xác định. Khi dòng điện được đặt vào, các mẫu chuyển động với một vận tốc khác, được xác định bởi khối lượng và điện tích (q) của chúng. Khi quá trình phân tách kết thúc, các thành phần của mẫu có các đặc điểm tương tự được phân lập thành một vùng riêng biệt.

Điện di trên gel là một ví dụ của ZE sử dụng chất nền sàng polyme làm môi trường hỗ trợ. Kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu hóa sinh và sinh học phân tử và công việc thường ngày do tính đơn giản và linh hoạt của nó. Do sự ra đời của môi trường hỗ trợ, ZE không thích hợp để phân tích tính linh động của các hạt mang điện mà bạn quan tâm cũng như xác định điểm đẳng điện (pI) của peptit hoặc protein.

3. Điện di isotacho, hoặc isotachophoresis (ITP)

Isotachophoresis hay ITP là một dạng điện di, trong đó tất cả các ion di chuyển với vận tốc bằng nhau (v). Trong ITP, các mẫu được đặt giữa hai dung dịch đệm không đồng nhất, bao gồm chất điện ly đầu ở một điện cực và chất điện phân cuối ở đầu kia. Cả hai chất điện phân đều có cùng loại điện tích với loại điện tích của phân tử quan tâm trong mẫu. Khi có dòng điện chạy qua, chất điện phân dẫn đầu sẽ có độ linh động cao nhất, tiếp theo là các hạt mang điện trong mẫu và chất điện phân cuối.

Khi ITP tiếp tục, các hạt mang điện trong mẫu sẽ bị dịch chuyển, dựa trên độ linh động điện (µ) và nồng độ của nó, theo thứ tự giảm độ linh động, dẫn đến một vùng liên tục của các hạt mang điện có các đặc điểm tương tự, bị kẹp bởi các vùng mà các ion nơi đầu và cuối bị chiếm đóng.

Thông tin từ điện di ITP được chuyển tải dưới dạng đồ thị cường độ điện trường theo thời gian, biểu thị nhận dạng của hạt mang điện và chiều dài của mỗi vùng biểu thị nồng độ của hạt mang điện.

Một nhược điểm lớn của hình thức này là chỉ có thể xác định một loại tích điện trong một cài đặt và một vòng ITP khác sẽ cần thiết để thu được thông tin về các hạt mang điện của loài khác.

4. Isoelectric focusing – IEF

IEF là hình thức điện di được thực hiện trong một pH gradient, chạy từ thấp đến cao – từ cực dương đến cực âm. IEF chỉ áp dụng cho các phân tử lưỡng tính vì chúng có thể cho và nhận proton, hoạt động như axit và bazơ. Ví dụ về các phân tử sinh học lưỡng tính là các peptit và protein, có các nhóm amin và axit cacboxylic.

Khi pH gradient được thiết lập và dòng điện được đặt vào, một mẫu lưỡng tính sẽ di chuyển về phía cực dương hoặc cực âm, tùy thuộc vào điện tích thực của mẫu. Tại điểm đẳng điện (pI), nơi điện tích thực của mẫu bằng không, vận tốc (v) và độ linh động điện (µ) của phân tử lưỡng tính trở thành 0, làm dừng sự di chuyển.

Tất cả bốn định dạng của điện di có thể được thực hiện ở cả hai chiều (2D). Điện di hai chiều được thực hiện bằng cách tiến hành điện di đầu tiên, tiếp theo là tách điện di thứ hai theo phương vuông góc với chiều thứ nhất. Điện di 2D có thể cung cấp thêm thông tin và độ phân giải, đặc biệt hữu ích cho các mẫu lâm sàng hoặc mẫu thực địa, thường yêu cầu phân tích chuyên sâu và mô tả đặc điểm nhưng chỉ được cung cấp với số lượng hạn chế.

CÁC LOẠI ĐIỆN DI

1. Điện di trên gel – Gel Electrophoresis

Điện di trên gel là một dạng điện di sử dụng gel, một mạng lưới polyme liên kết ngang không chất lỏng, làm môi trường hỗ trợ để duy trì giá trị pH ổn định trong dung dịch đệm, hoạt động như một chất ổn định chống đối lưu. Nó cũng đóng vai trò như một chất nền phân tách, do tính chất xốp của nó có tác dụng lọc các hạt lớn và cản trở các hạt nhỏ hơn trong quá trình phân tách điện di.

Gel được đúc thành dải hoặc phiến có khe hoặc giếng mẫu. Khi nó đã được polyme hóa hoàn toàn, gel được ngâm trong dung dịch đệm điện di, và các mẫu được nạp vào mỗi giếng trước khi dòng điện được đưa vào để bắt đầu tách điện di. Vào cuối quá trình điện di trên gel, các thành phần trong mẫu sẽ được tách ra dựa trên khối lượng của chúng.

Như đã đề cập trước đó, điện di gel là một trong những loại điện di được sử dụng nhiều nhất trong nghiên cứu và chẩn đoán thông thường do tính dễ sử dụng và tính linh hoạt của chúng. Nó có thể được điều chỉnh để tách nhiều loại phân tử sinh học khác nhau bằng cách thay đổi loại polyme được sử dụng để đúc gel và bằng cách điều chỉnh thành phần của polyme, làm thay đổi kích thước lỗ của gel.

Các loại gel

• Polyacrylamide, một loại gel trong suốt được tạo ra từ sự đồng trùng hợp của các monome acrylamide với sự có mặt của chất liên kết chéo, N, N-methylene-bisacrylamide, thường được gọi là ‘bis-acrylamide’. Phản ứng trùng hợp được xúc tác bởi amoni persulphat (APS) và N, N, N ‘, N’-tetramethylenediamine (TEMED). Kích thước lỗ của gel polyacrylamide được xác định bởi nồng độ acrylamide, nồng độ này phải tương ứng với chất tạo liên kết chéo của nó. Nói chung, một tỷ lệ thấp của gel acrylamide (3% -15%) được sử dụng để tách DNA và protein. Gel acrylamide phần trăm cao hơn (10% -20%) thường được sử dụng trong điện di trên gel natri dodecyl sulfate (SDS) -polyacrylamide (SDS-PAGE), trong đó các protein được tách ra trong điều kiện biến tính, tùy theo kích thước của chúng.
• Agarose, một polysaccharide mạch thẳng tự nhiên được tạo thành từ chuỗi galactose và 3,6-anhydrogalactose, được chiết xuất từ ​​thạch được phân lập từ rong biển đỏ. Agarose, giống như thạch, được bảo quản dưới dạng bột khô. Để tạo gel agarose, bột agarose được hòa tan trong dung dịch đệm có liên quan, đun nóng và để nguội đến nhiệt độ phòng. Tương tự như gel polyacrylamide, nồng độ của agarose trong dung dịch đệm xác định kích thước lỗ của gel. Gel agarose thường được sử dụng ở mức 0,8% (w / v) đến 5% (w / v) để tách các phân tử DNA và RNA. Agarose có thể được sử dụng kết hợp với SDS để tách các protein có trọng lượng phân tử cao, điều này có thể gặp vấn đề khi tách bằng SDS-PAGE.

Gel agarose (polymer polygalactose) được sử dụng khá phổ biến, đặc biệt là trong ứng dụng với những đa phân tử như acid nucleic, lipoprotein v.v.

Xem thêm: Bộ điện di ngang

2. Pulsed-field Gel Electrophoresis (PFGE)

Điện di gel trường xung (PFGE) là một biến thể của điện di trên gel, trong đó hai điện trường được áp dụng định kỳ, xoay vòng, vào điện di gel ở các góc độ khác nhau. Loại điện di này được thiết kế đặc biệt để tách nhiễm sắc thể, là các phân tử DNA có trọng lượng phân tử cao trên 20 kilobase.

Không giống như các phân tử DNA nhỏ hơn, các phân tử DNA trọng lượng phân tử cao ở dạng nén, khiến chúng di chuyển theo một cách thức không phụ thuộc vào kích thước. Trong quá trình áp dụng điện trường đầu tiên, các phân tử DNA cuộn lại được kéo căng và sẽ di chuyển qua gel. Tuy nhiên, sự kết thúc và sự thay đổi hướng của điện trường buộc các phân tử DNA lớn này phải tự định hướng lại trước khi quá trình di chuyển có thể tiếp tục.

Các phân tử lớn hơn sẽ chậm hơn trong quá trình tái định hướng và di chuyển, so với các phân tử nhỏ hơn do thời gian giãn nhớt lâu hơn. Việc áp dụng lặp đi lặp lại hai điện trường xen kẽ từ các góc khác nhau cuối cùng sẽ tiết lộ khoảng cách di chuyển xa hơn đối với phân tử DNA có trọng lượng phân tử nhỏ hơn và khoảng cách di chuyển ngắn hơn đối với DNA có trọng lượng phân tử lớn hơn.

3. Điện di mao quản (Capillary Electrophoresis – CE)

Điện di mao quản, còn được gọi là Điện di mao quản hiệu suất cao (HPCE), là một loại điện di được thực hiện trong một ống mao dẫn hẹp được ngâm trong dung dịch đệm điện phân. Đây là loại điện di duy nhất có khả năng thực hiện cả bốn loại điện di. Mao mạch thường dài 20-30 cm và có đường kính trong 25-75 micromet.

Sự phân tách điện di được bắt đầu khi một mẫu được bơm vào mao quản, bằng điện áp cao hoặc bằng áp suất, và điện trường cao được áp dụng qua mao quản. Các thành phần trong mẫu được phân tách dọc theo chiều dài của mao quản, dựa trên định dạng điện di được thực hiện. Về phía đầu kia của ống mao dẫn, các thành phần đã tách biệt được phát hiện tại máy dò, tại đó thời gian phát hiện hoặc thời gian lưu được tự động ghi lại.

Vì CE được thực hiện trong một ống mao dẫn hẹp nên chỉ cần một thể tích mẫu rất nhỏ để tách. Một ưu điểm chính khác của CE là hệ thống thiết bị đo đạc tự động, cho phép phân tích thông lượng cao.

4. Điện di miễn dịch (Immunoelectrophoresis)

Điện di miễn dịch là một loại điện di có các kháng nguyên riêng biệt, bao gồm protein và peptit, dựa trên phản ứng và tính đặc hiệu của chúng đối với kháng thể, hoặc globulin miễn dịch (Ig). Sự gắn kết của kháng nguyên với kháng thể tương ứng của nó ở một tỷ lệ kháng nguyên / kháng thể cụ thể, hoặc điểm tương đương, sẽ dẫn đến sự kết tủa của phức hợp kháng nguyên-kháng thể. Do đó, các kháng nguyên trong một mẫu quan tâm có thể được tách ra dựa trên khả năng liên kết của chúng với một kháng thể nhất định.

Các cài đặt hiện đại cho điện di miễn dịch dựa trên các sửa đổi của điện di vùng và điện di trên gel. Điện di miễn dịch có thể được thực hiện ở chế độ một chiều hoặc hai chiều.

5. Điện di ái lực (Affinity Electrophoresis)

Điện di ái lực là một loại điện di phân tách một phân tử sinh học tương tác với hoặc liên kết với một phân tử khác mà nó có ái lực. Nó sử dụng hiện tượng mà độ linh động điện (µ) thay đổi khi một phân tử sinh học, bao gồm axit nucleic, protein, peptit và polysaccharid, liên kết với một phân tử khác, và sự thay đổi về độ linh động điện này sẽ được phản ánh trong dạng điện di.

Do đó, các phân tử sinh học quan tâm trong một mẫu có thể được tách ra dựa trên ái lực của chúng với phân tử khác – cho dù các phân tử sinh học quan tâm có xu hướng liên kết với phân tử khác nhiều hơn phân tử sinh học không mong muốn khác hay không. Các cài đặt hiện đại cho điện di ái lực dựa trên điện di gel hoặc điện di mao quản (Kinoshita và cộng sự, 2015).

THIẾT BỊ THỰC HIỆN

Tất cả các loại điện di đều tách các hạt mang điện trong khi chúng chìm trong dung dịch đệm. Tất cả các hình thức điện di đều cần có nguồn điện và bộ phận điện di, thường được gọi là buồng điện di. Nguồn điện cung cấp dòng điện cho buồng đẩy sự phân tách điện động. Buồng này bao gồm hai điện cực đối diện, cực âm và cực dương, và của một bể chứa dung dịch đệm, trong đó các mẫu và quá trình phân tách chúng diễn ra (Walker, 2010).

Việc sử dụng nguồn điện và buồng điện di cũng được yêu cầu đối với tất cả các loại máy điện di. Tuy nhiên, mỗi định dạng cần thiết bị cụ thể để thiết lập quá trình tách. Ví dụ, khay caster, đĩa thủy tinh và lược là điều kiện tiên quyết để điện di gel. Điện di mao quản yêu cầu một hệ thống làm mát bên trong có hiệu quả ngăn chặn sự gia nhiệt quá mức và cung cấp một điều kiện ổn định nhiệt trong quá trình điện di.

Nhìn chung, điện di là một kỹ thuật tách có thể tách ra các phân tử sinh học hoặc các hạt mang điện, dựa trên tính di động của chúng trong một điện trường nhất định. Tính linh động có thể là sự phản ánh các đặc điểm của các phân tử sinh học hoặc các hạt quan tâm hoặc là kết quả của sự tương tác của chúng với một phân tử khác. Khi kết hợp với các kỹ thuật khác, điện di có thể tạo ra một công cụ mạnh mẽ và toàn diện có thể áp dụng cho nghiên cứu, phân tích và chẩn đoán.

Để nhận tư vấn về các thiết bị điện di, vui lòng liên hệ trực tiếp: 098.123.0055

Nguồn tham khảo:  https://conductscience.com/introduction-to-electrophoresis/